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偏振仪
概述

    光由微小的波构成,光波可以在任何一个平面上均匀的振动。当其通过某些平面时,有可能因受到平面的作用将光波的能量分成不均匀的光束,振动平面也就发生了变化,可能在某一个方向的振动强或弱于其他平面,这种光称为偏振光。化学研究中常用到偏振光理论,这是因为偏振光在通过含有某种分子的溶液时,其振动性质将发生改变,如偏振平面受到扭转,根据扭转的方向和角度的变化,就能够对溶液中分子的结构作出推断。
    Perrin于1926年首先描述了荧光偏振理论,他观察到溶液中的荧光分子在受到偏振光激发时,如果在激发时分子保持静止,该分子将发出固定偏振平面的发射光(发射光仍保持偏振性)。然而,如果分子旋转或翻转那么发射光的偏振平面将不同于初始激发光的偏振平面。 
分子的偏振性与分子旋转驰豫时间成比例,分子旋转驰豫时间是分子转过68.5度角时所用的时间。分子旋转弛豫时间(分子弛豫指分子由一种激发态跃迁到另一能量较低的激发态或基态的过程,弛豫不是瞬时即逝的,所以激发态有一定的寿命,称为弛豫时间。)与粘度、绝对温度、分子体积和气体常数有关。
    偏振仪,可用于荧光强度,时间分辨荧光,荧光偏振,吸收光和化学发光的检测。

原理

    当荧光分子受平面偏振光激发时,如果分子在受激发时期(对于荧光素约持续4纳秒)保持静止,发射光将位于同样的偏振平面。如果在受激发时期,分子旋转或翻转偏离这一平面,发射光将位于与激发光不同的偏振面。如果用垂直的偏振光激发荧光素,可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强(发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关)。如果分子很大,激发时发生的运动极小,发射光偏振程度较高。如果分子小,分子旋转或翻转速度快,发射光相对于激发光平面将去偏振化。任何物质都处于不断运动当中,液态环境中的荧光分子也不例外。因此当受到偏振光激发时,荧光分子的运动状态例如旋转、翻转、相互结合、排斥、溶液的粘度、温度等这些因素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的偏振光的性质产生影响。对此进行分析比较,有可能揭开物质活动的内在规律,达到研究目的,“荧光偏振”。近年来,以这种物理学现象为基础的技术在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。因此,我们可以看到,以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用,以及分子与所处环境——“小”至核酸和蛋白结构,“大”至整个细胞——的相互作用。相对于传统研究方法,荧光偏振技术在溶液中进行,可最大程度的模拟真实生命环境;利用它,可以实时跟踪监测分子间结合/分离的变化,并解决一直以来困扰荧光技术使用者们对于荧光无法定量的烦恼。最为重要的是,相对于一直被人们使用的放射性同位素研究方法,它更为安全可靠,不会在实验过程中对研究者造成威胁,也不会产生难以处理的具有放射性的废弃物。此外,荧光偏振所需的样品量少,灵敏度高,重复性好,操作简便。
    荧光偏振分析是利用荧光偏振的原理,通过检测荧光素标记的小分子与其它分子相互作用前后分子量的变化,计算水平方向及垂直方向的荧光偏振值作相关分析。如果被检测分子大,激发时运动慢,测得的荧光偏振光值高。如果分子小,分子旋转或翻转速度快,发射光相对于激发光平面将去偏振化,测得的偏振光值低,从而计算出样品的偏振值(偏振值单位MP)。通过专用分析软件,可对检测结果进行分析,判别等工作。

技术优势

    荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势(特别是不生成有害的放射性废物)并且检测限更低,可达亚纳摩尔级范围。此外荧光偏振是真正均相的,允许实时检测(动力学检测),对于浓度变化不敏感,是均相检测形式(中间不含洗涤步骤)的最佳解决方案。

应用领域

    荧光偏振是特别用于研究分子间相互作用的技术。这种方法直接及时的检测示踪分子的结合/自由率。荧光偏振实验在没有固相支持的溶液中进行,允许在低至皮摩尔级的范围内分析真实的平衡。荧光偏振检测并不掺杂样品,因此样品可以被再次处理并被重新分析用于评价pH、温度和盐浓度改变对结合的影响。此外,荧光偏振实验是实时进行的,并不局限于平衡结合的研究。
    应用领域
    1、受体/配体研究(如激素/受体检测)
    2、蛋白质/多肽相互作用
    3、DNA/蛋白质相互作用
    4、酪氨酸激酶检测
    5、竞争性免疫检测

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