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基因扩增仪(PCR)
概述

    聚合酶链式反应,英文全称是Polymerase Chain Reaction,简称PCR。聚合酶链式反应,又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术,是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA、RNA的地方。
    它可以在试管里建立反应,经过数小时之后,就能将极微量的目的基因或者某一特定的DNA片段扩增数十万倍,乃至千百万倍,而无需通过繁琐费时的基因克隆程序,便可获得足够数量的精确的DNA拷贝,所以有人亦称之为无细胞的分子克隆法。

PCR反应的三个步骤

    1、Denaturation(变性) : Denaturing乃是将DNA加热(至90~95℃)变性,将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板。
    2、Annealing of primers(退火) : 则是令Primers于一定的温度下(冷却至55~60℃)附着于模板DNA两端。
    3、Extension of primers(延伸) : 最后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase的作用下(加热至70~75℃)进行引物的延长Extension of primers及另一股的合成。

PCR基因扩增仪的发展过程

    简单的说,PCR基因扩增仪就是一个精密的温度控制仪,随着现代制造业的发展,它经历以下的过程:

水浴锅控温PCR仪
压缩机控温PCR仪半导体控温PCR仪
离心式空气加热控温PCR仪

基因扩增仪分类

    1、普通的基因扩增仪
    把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪,叫传统的PCR仪,也叫普通PCR仪。如果要做不同的退火温度需要多次运行。主要是做简单的,对目的基因退火温度的扩增。该仪器主要应用于科研研究,教学,医学临床,检验检疫等机构。
    2、梯度基因扩增仪
    把一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(温度梯度),通常有12种温度梯度,这样的仪器就叫梯度PCR仪。因为被扩增的不同DNA片段,其最适退火温度事不同,通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR扩增,就可以筛选出表达量高的最适退火温度,进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增,这样节约成本的同时也节约了时间。主要用于科研,教学机构。梯度PCR仪,在不设置梯度的情况下也可以做普通PCR扩增。具有双槽梯度的不多,领成具备此功能。
    3、原位基因扩增仪
    用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪,如病源基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。是保持细胞或组织的完整性,使PCR反应体系渗透到组织和细胞中,在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增,不但可以检测到靶DNA,又能标出靶序列在细胞内的位置,于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有重大的实用价值。
    4、实时荧光定量基因扩增仪
    在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统,就成了荧光定量PCR仪。其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同,只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出。把这PCR仪叫做实时荧光定量PCR仪(qPCR仪)。荧光定量PCR仪有单通道,双通道,和多通道。当只用一种荧光探针标记的时候,选用单通道,有多荧光标记的时候用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记的目的基因表达产物,因为一次只能检测一种目的基因的扩增量,需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。该仪器主要用于医学临床检测,生物医药研发,食品行业,科研院校等机构。
    实时荧光定量基因扩增仪又有三种类型:
    (1) 金属板式实时定量基因扩增仪
    可作为普通PCR仪使用;
    可带梯度功能;
    可容纳的样本量大,无需特殊耗材;
    温度均一性欠佳,有边缘效应,标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致。
    (2) 离心式实时定量基因扩增仪
    温度均一性较好;
    使用的是同一个激发光源和检测器,随时检测旋转到跟前的样品,有效减少系统误差;
    可容纳样品量少,有的需用特殊毛细管作样品管,增加了使用成本,也不带梯度功能。
    (3) 各孔独立控温的定量基因扩增仪
    不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块,各孔独立控温,适合多指标快速检测;
    部分仪器的软件允许一台仪器同时操作多个样品模块,既满足高速批量要求,又能灵活运用,还可实现任意梯度反应。

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