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DNA测序仪/基因测序仪
简介

    基因测序仪(即DNA测序仪),是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定基因片段的精密仪器。目前已经发展到第三代基因测序仪。

仪器应用

    可广泛用于基因测定,癌细胞的表达普测定、亲子鉴定、个体识别、基因档案、父系鉴定、母系鉴定、种族鉴定、种属鉴定、传染病毒的测定及胎儿遗传缺陷的分析,比如癌细胞有起固有的表达方式,通过测定可得知人体癌细胞的发生和变化情况。另外,国产第三代基因测序仪的研发将极大地拓宽生命科学、生物化学、生物医药等领域,广泛地应用临床医学、生物能源等。

原理


    (一)双脱氧链末端终止法
    1977年,Sanger等人发展建立起来的一种DNA测序方法。其基本原理为:
    双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂—类似于正常dNTP的2',3'-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),将延伸的DNA链特异性地终止。其反应体系也包括单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶。共分四组,每组按一定比例加入一种(ddNTP),它能随机渗入合成的DNA链,一旦渗入合成即终止,于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸,可以从放射自显影带上直接阅读DNA的核苷酸序列。
    与dNTP相比,ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟基,反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下,通过其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH发生反应,形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中,但它们本身没有-OH,不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键,从而使正在延伸的DNA链在此终止。据此原理分别设计四个反应体系,每一反应体系中存在相同的DNA模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP),则新合成的DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可能掺入ddNTP而导致新合成链在不同的位置终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争,生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。
    特点:双脱氧链末端终止法不仅具有化学测序法的优点,而且更适用于大规模的测序。但它要求有一个纯净的单链DNA模板和一个合成反应所需的特异性的引物。因此,早期的工作仅局限于单链噬菌体为模板,若干个不同的特定限制性内切酶酶解片段为引物,在模板链的不同部位引导合成,从而确定出噬菌体DNA的核酸序列。然而,对于大量存在着的天然双链DNA分子,因没有良好的制备产量和质量高的分离链的技术,而限制了双脱氧链末端终止法的应用程度。  
    (二)新生链的荧光标记
    早期采用同位素法标记新生链,因其具有放射性危害、背景高等缺点而很快被荧光染料标记法所取代。荧光染料的荧光和散射背景较弱,提高了信噪比;它们的激发光谱较接近而发射光谱均位于可见光范围,且不同染料的发射光谱相互分开,易于监测,故在DNA自动测序中得到广泛应用。
    荧光染料标记法分为:
    1、单色荧光标记法。包括荧光标记引物法、荧光标记终止底物法;
    2、多色荧光标记法。包括荧光标记引物法、荧光标记终止底物法。
    标记原理:
    1、多色荧光标记法——荧光标记引物法
    将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5'端;一组(4种)荧光标记引物,其序列相同,但标记的荧光染料颜色不同;测序反应中,模板、反应底物、DNA聚合酶及标记引物等按A、T、 C、G编号被置于4支微量离心管中,A、T、C、G四个测序反应分管进行,上样时合并在一个泳道内电泳。特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸底物保持对应关系。
    2、多色荧光标记法——荧光标记终止底物法
    将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上;反应中将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记,带有荧光基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终止的同时,也使该片段端标上了一种特定的荧光染料;经电泳后将各个荧光谱带分开,根据荧光颜色的不同来判断所代表的不同碱基信息。
    荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的异同点:
    1、都确定了4种荧光染料与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的专一对应关系;
    2、荧光标记引物法使荧光有色基团标记在长短不同的DNA片段的端,可理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端,且标记发生在引物与模板的退火过程中,而终止是发生在片段延伸过程中,两者在时间上有一定间隔;
    3、荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一,两者在同一时间完成 在具体操作中,前者要求A、C、G、T四个反应分别进行,而后者的四种反应可以在同一管中完成。
    单色荧光标记法:
    也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法;与多色荧光标记法不同的是单色荧光标记引物法和荧光标记终止底物法均需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行,电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳
    单色荧光标记法与多色荧光标记法的异同点:
    1、均可分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法;
    2、单色荧光标记法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行,电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳;
    3、多色荧光标记引物法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行,电泳时可合并在同一泳道中电泳;
    4、多色荧光标记终止底物法可将A、C、G、T四个反应在同一扩增管中进行,电泳时在同一泳道中电泳。
    荧光标记DNA的检测原理
    1、测序反应一般以单引物进行DNA聚合酶延伸反应,绝大多数产物均为单链;
    2、反应结束后,样品经简单纯化处理就可以放置到自动测序仪中开始电泳;
    3、两极间极高的电势差推动着各个荧光DNA片段在凝胶高分子聚合物中从负极向正级泳动并达到相互分离,且依次通过检测窗口由激光器发出的极细光束,通过精密的光学系统被导向检测区,在这里激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光DNA片段;
    4、DNA片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光;
    5、代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到CCD摄像机上同步成像。收集的荧光信号再传输给计算机加以处理;
    6、整个电泳过程结束时在检测区某一点上采集的所有荧光信号就转化为一个以时间为横轴坐标,荧光波长种类和强度为纵轴的信号数据的集合;
    7、经测序分析软件对这些原始数据进行分析,最后的测序结果以一种清晰直观的图形显示出来
    多色荧光标记技术检测优点:
    1、一个样本的四个测序反应产物可以同时在一个泳道内电泳,避免单一标记时四个泳道测序因泳道间迁移率不同对精确度的影响,提高了测序精度;
    2、一个样品所有反应产物只需进样一次,所以一次实验便可以处理较之手工方法更多的样品。在相同样品数的情况下,加样的工作量也大大减少。
    影响实验结果的因素:
    1、模板的影响:模板DNA不纯;定量不准;难测模板;
    2、循环测序反应条件:引物的影响;富含GC的模板;
    3、电泳的影响。

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