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化学发光免疫检测
概述

    化学发光免疫检测(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合,用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。

发展史

    上世纪70年代中期Arakawe首先报道CLIA ,发展至今已经成为一种成熟的、先进的超微量活性物质检测技术,应用范围广泛,近10年发展迅猛,是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法,也是目前最先进的标记免疫测定技术,灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级,可以完全替代放射免疫分析、彻底淘汰酶联免疫分析。主要具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定且有效期(6-18个月)、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点。高灵敏度的化学发光检测技术以被广大研究人员所认可,并正逐渐替代传统的生物检测技术。
    化学发光与放射免疫法是公认的肿瘤标志物和各种激素最精确和最成熟的检测方法,二者的原理、技术与方法早已成熟并被国外各大医院用于肿瘤检测和激素检测,二者的试剂与仪器均通过美国FDA认证与我国药监局的批准。但是,放射免疫分析法虽有很高的灵敏度,却存在放射性防护和同位素污染的问题,况且试剂价格昂贵只有一个有保质期,在基层医疗机构难以普及。化学放光免疫分析仪继承了放射免疫的所有优点,同时克服了放射免疫和酶联免疫各自的缺点,是临床免疫检测最理想的新方法。可以肯定的说,她将取代放射免疫和酶联免疫成为临床免疫检测最理想的新技术。

检测原理

    化学发光免疫分析包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子(hM),利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原(化学发光免疫分析)或抗体(免疫化学发光分析)上,或酶作用于发光底物。

化学发光免疫分析的优势

    1、灵敏度高
    灵敏度高是化学发光免疫分析关键的优越性,其灵敏度可达 10-22 mol/L(RIA 为 10 -12 mol/L)。化学发光免疫分析能够检出放射免疫分析和酶联免疫分析等方法无法检出的物质,对疾病的早期诊断具有十分重要的意义。
    2、宽的线性动力学范围
    发光强度在4~6个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。这与显色的酶免疫分析吸光度(OD 值)为2.0的范围相比,优势明显。虽然 RIA 也有较宽的线性动力学范围,但放射性限制了其应用。
    3、光信号持续时间长
    辉光型的 CLIA 产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天。简化了实验操作及测量。
    4、分析方法简便快速
    绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂(或复合试剂)的一步模式。
    5、结果稳定、误差小
    样品系直接自己发光,不需要任何光源照射,免除了各种可能因素(光源稳定性、光散射、光波选择器等)给分析带来的影响,使分析结果灵敏稳定可靠。
    6、安全性好及使用期长
    免除了使用放射性物质。到目前为止,还未发现其危害性;试剂稳定,保存期可达一年。

化学发光免疫分析的类型

    化学发光免疫分析法根据其标记物的不同可分为三大类,即化直接化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。
    1、直接化学发光免疫分析
    用吖啶酯直接标记抗体(抗原),与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物,这时只需加入氧化剂(H2O2)和NaOH使成碱性环境,吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。
    由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能,这部分光的积分与待测抗原的量成正比,可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。

夹心法

磁微粒技术

    2、化学发光酶免疫分析
    化学发光酶免疫分析(chemiluminescence  enzyme  immunoassay,CLEIA)是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体,在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物,经洗涤后,加入底物(发光剂),酶催化和分解底物发光,由光量子阅读系统接收,光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大,再把它们传送至计算机数据处理系统,计算出测定物的浓度。
    (1) 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析
    该分析系统采用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体(或抗原),在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-酶(HRP)标记抗体复合物,这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。

辣根过氧化酶标记化学发光免疫分析示意图

    (2) 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析
    该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体(或抗原),在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物,这时加入AMPPD发光剂,碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。

碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图

    3、电化学发光免疫分析
    电化学发光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA)是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原),以三丙胺(TPA)为电子供体,在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应,它包括电化学和化学发光两个过程。
    在电化学发光免疫分析系统中,磁性微粒为固相载体包被抗体(抗原),用三联吡啶钌标记抗体(抗原),在反应体系内待测标本与相应的抗原 (抗体)发生免疫反应后,形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物,这时将上述复合物吸入流动室,同时引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时,被安装在电极下面的电磁铁吸引住,而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压,启动电化学发光反应,使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移,产生电化学发光,光的强度与待测抗原的浓度成正比。

电化学发光免疫分析示意图 - 1
电化学发光免疫分析示意图 - 2
标记磁颗粒在电场中发光工作示意图

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