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核磁样品如何制备?
2020.10.15   点击150次

样品的温度、观测核的频率和样品中自旋核的数目都会影响检测信号的强度。将样品的浓度尽可能最大化并降低样品的温度方面来改进检测灵敏度的方式不是在任何情况之下都可行的。增加溶质的量和降低溶液温度会增加溶液粘度,从而降低谱图的分辨率,因此粘度引起的谱峰增宽实际上降低了信噪比。

配制高质量的样品溶液是得到理想核磁数据的前提条件。下面介绍配置高质量样品的一些基本原则。

1、核磁样品管的选择

尽可能选择经济承受范围以内的最高质量核磁样品管。样品管的直径与核磁核磁探头的线圈直径相匹配。除非没有其他的选择,不要把5mm的样品管放在10mm的探头里面。在任何情况下,绝对不能使用比探头线圈直径大的样品管。对于大多数的有机样品,wilmad 527-pp-7(国外报价10美元以内)或者同等质量的样品管就能够满足需要。价格便宜的样品管管壁厚度不一,这种不均匀性使得样品在匀场过程中很难甚至不可能达到很好的状态。同轴性、曲面、横截面的不均匀性都限制了数据的质量。另外,核磁管可以多次使用,高质量核磁管的额外花费在多年的使用过程很容易就会回报回来。

2、样品的纯度

样品纯度越高越好。核磁实验希望样品有高的溶解度,但是样品的纯度高更好。如5mM高纯度产物比20mM掺杂有其他异构体或者中间反应产物更好。为了采集到的13C信号更强,可以在做样品提纯之前先测试一维的碳谱。根据氢碳-HMQC/HSQC和HMBC图谱结果能帮助区分出混合物中1D谱图里的假峰。在机时紧张的情况下,很难保障提纯后的样品能够得到信噪比足够高的13C谱。也就是说,提纯后低浓度的样品花24个小时采集的一维碳谱有可能在我们希望能够观测到季碳化学位移的范围内只看到噪声。扫描4天后虽然能够加倍信噪比,但是在多用户使用的条件下也是不可行的。因此如果我们只有少量的产品,可以通过二维技术,避免重复合成、分离、提纯和样品的准备,在不用扫描一维13C谱的情况下,还是能够完全的指认我们分子的1H和13C谱峰。

3、氘代溶剂的选择

使用高质量的氘代试剂。尽可能使用一次性的0.5到0.6毫升的小瓶试剂,而不是用容量为50或者100g的大包装试剂。氘代氯仿保存时间超过6个月会降解产生酸性,因此会交换溶质分子中的不稳定氢。如果溶质分子包含有低的pKa的氢原子或者被酸催化会被降解时,必须要特别注意这一点。

4、核磁管的清洗

当使用样品管的时候,即使是新样品管,也要进行彻底的清洗。如果清洗核磁管不当,会检测到核磁管残留的溶剂信号。一般情况下把样品管浸泡在钟酒精浴中30秒能够解决此问题。注意,当进行此步骤的时候,需要带上手套、实验服或者围裙、安全口罩或者面罩。

有时候,使用正确的方式清洗核磁管也会不可避免的引起物理磨损。在这种情况下,我们就要轻轻的擦洗核磁管的内壁和外壁。可以用管刷来清洁5mm样品管,但是必须非常小心以免管刷尾部暴露的金属刮坏核磁管的内壁。

另外也可以使用核磁样品管清洗器。如果可能,使用色谱或者光谱纯度水或者丙酮用于最后的冲洗。最好的冲洗最好不要使用DMSO,除非接下来需要重新使用DMSO溶解样品。这是因为DMSO蒸气压力低而造成其挥发慢。注意:在使用DMSO时一定要戴手套。如果DMSO溶液接触到我们的皮肤,DMSO就会将溶质透过皮肤直接导入到我们的体内血液循环中去。

5、核磁管的干燥

烘干价格昂贵的核磁管时,尽量把核磁管平放在厨房用纸或者干净的织物上面。不要把核磁核磁管竖直放在容器或者烧瓶中存放,不要把样品管放在干燥箱中超过一分钟。价格昂贵的核磁核磁管同心性和弧度非常高,壁厚和玻璃组成成分非常均匀。管壁越厚,玻璃管在平面上滚动越快。如果将核磁管直立在干燥箱的容器内,地心引力会将核磁管弯曲,改变本来的弧度。如果将核磁管平放太长时间,它们也会形成一段椭圆形的部分,因而同心性会变差。而薄的管壁比较容易破损。

另外,核磁管可以用核磁管检测器来检查同心性和弧度。核磁管检测器可以从Wilmad或者其他厂商买到。

6、样品混合

如果样品有限,并已经样品溶解到溶剂中,必须确认溶液完全混合。但是,在混合样品时必须很小心,因为标准高密度聚乙烯材质的核磁核磁管帽子可被常用的氘代核磁溶剂溶解(至少染色剂会被溶解)。用振荡器可以实现有效混合,但是也有例外。核磁核磁经验丰富的人经常用一只手轻轻的握住核磁管,用手指拍打来加速混合和溶解(对薄壁核磁管一定要特别小心,例如wilmad 535-pp或者更高质量)。有时可用细长巴斯德吸液管重复吸走再引入来加速混合。重水样品在混合过程中容易产生气泡,因此必须小心不要太用力的混合。

7、样品的体积

配制溶液的体积会影响到匀场速度。在5mm直径的核磁核磁管里,体积为0.6-0.7ml的溶液最适宜的。

每一台核磁核磁谱仪都配有一个高度量筒来准确标定核磁管相对于探头检测线圈的位置。如图1所示,当转子-样品管装好并放进磁体之后核磁核磁管的样品将处于探头的检测器区域,(检测器在电阻器-电感线圈-电容器回路中的电感线圈)。在把核磁管放进转子之前,需要小心翼翼的擦拭核磁管(指纹会有信号并妨碍平稳转动)。利用高度量筒将核磁管在转子里定位,一旦样品管-转子在空气的帮助下放入磁体内,溶液的上表面(溶液凹面)和下表面(管子底部)到检测区域的中心是等距的。

千万不要让样品管超出转子中样品深度的最大值,这样将导致样品管放入的时候损坏核磁管或探头上的玻璃保护套。如果样品管的溶液过高,不能把溶液的中心对准检测区域的中心。此时,把转子中的样品管推到最低深度,此时凹面到检测中心的距离长于核磁管底部到检测中心的距离。

8、样品浓度

理想情况下,我们尝试使用一个样品浓度的平衡。如果我们的样品太稀,采集一个简单的一维谱图可能会花掉几个小时的时间。如果样品太浓,信号峰会因高浓度引起的粘度过高,分子转动速度变慢而增宽。分子转动速度慢只会部分平均偶极和化学位移张量,不能实现各个方向的平均。只有各个取向的平均才能观测到窄的共振峰。

a、溶质过量的情况

当样品充裕的时候,配制溶液应当确保均匀。首先必须避免固体存在于核磁管中,一个例外情况是干的分子筛(或者干燥剂)在核磁样品管的底部,远离检测区域。如果想要配制饱和溶液又不担心粘度高引起核磁核磁谱峰增宽,可加入过量溶质充分混合之后再过滤。

没有过滤的溶液也可以进行核磁检测,但是这种实验的结果一般不是很理想,因为这会丢失掉很多有用的细节信息,同时会引起核磁谱峰增宽。固体和液体的磁化率(让磁场线透过材料的能力)有很大差别,因此尽量避免能够引起谱线增宽的因素。溶液的不均一性将导致磁场不均匀,这种不均匀性很难通过匀场线圈进行有效的补偿。新手描述溶液中的固体存在方式为漂浮(在溶液顶部的固体)或者沉淀(在溶液底部的样品)或者悬浮(在溶液中部的固体)。在这三种情况中,悬浮引起的问题更多,因为这些固体会不断的进出检测区域。每个没有溶解的溶质颗粒通过检测区域时都会有磁场均匀性的畸变。

溶液在放入核磁样品管之前首先要过滤固体颗粒。当使用传统核磁样品管的时候,样品的温度必须一直保持在溶剂的沸点以下,尤其是当使用腐蚀性的溶剂如三氟醚乙醇(TFE)和三氟乙酸(TFA)时更要如此。因为加热样品会给核磁样品管造成额外的压力,样品管的帽子可能会崩开,样品管内的溶液会喷出溅到磁体上部的腔体上,然后滴落到核磁探头内,因而对仪器造成很大的损害。在核磁管帽周围包裹聚氯乙烯绝缘带可以防止样品在加热的过程中帽子被弹出,但是更可行的方法是使用特殊的核磁管,例如J.Young核磁管。

b、溶质有限的情况

当溶质量有限且溶解度很高时,可以尝试减少溶液总体积来增加浓度。但是溶液体积太少会引起谱峰增宽,从而降低了信噪比。这种谱峰变宽是由于检测区域附近磁场的不均匀造成的,也就是,减少溶液的体积来增加浓度经常会利大于弊。

如果样品的量虽然少,但是稀释之后可以在仪器时间允许的情况下完成实验,此时,我们可以借助于使用磁化塞子,shigemi管,甚至特殊的探头(价格昂贵的可用特殊核磁管),例如布鲁克80微升样品容量的微量探头或者瓦里安40微升样品容量的nano探头。在400MHz或者500MHz 核磁谱仪上,经验证明扫描浓度低于2mM样品的2D谱图是有问题的。扫描浓度低于5mM样品的一维碳谱也是有问题的。在200 MHz或者300MHz 核磁谱仪上,需要的样品浓度大约是上述要求的两倍。

9、最优化的溶质浓度

一般而言,获取优质核磁图谱的样品浓度在20-50mM范围之间。溶液粘度引起的偶极作用或者化学位移各向异性引起的谱线增宽的临界点会依据溶质的量、溶剂、温度和核磁操作者判断而改变。

样品浓度对于核磁测试非常重要。假设浓度为20mM的样品,花费30秒钟时间采集氢谱(扫描4次),其中非耦合甲基峰的信噪比为100:1。同一样品浓度为1.4mM时,该甲基峰的信噪比是多少呢?

信号强度Si直接正比于扫描次数n和样品的浓度Ci,但是噪声部分被抵消,只有扫描次数的平方根。因而信噪比的增长为扫描次数的二分之一次方。

如果20mM样品采样30秒的信噪比为100:1,1.4mM样品相同条件下信噪比则为1.4/20×100:1或者7:1。

1.4mM样品要得到20mM样品(30秒)的信噪比,必须增加两个浓度比例平方的采样时间,即使用核磁仪器时间(98分钟)得到同样的信噪比。

10、避免样品的降解

在前面提到,使用一次性溶剂溶解样品,尽可能阻止样品发生化学反应包括不稳定的质子交换。使用有机溶剂的时候,尽可能保持样品无水,如在5mm样品管的底部放入分子筛,保持分子筛边缘处于样品的检测区域以外。

尽可能减少样品暴露在氧气和水蒸气中的时间,方便的话在手套箱中准备样品。如果要保证核磁管内的样品处在惰性的环境中,可以先使用乳胶膜取代聚乙烯帽子密封我们的样品管,然后使用插管透过乳胶膜将溶液倒入到样品管中。但是乳胶膜随着时间变长可渗透氧气和水蒸气。把另一个保护套套在核磁样品管帽子上也会降低水蒸气和氧气进入引起的降解。要意识到样品管卖家在销售时不会清洗样品管。

本文来自:实验室经理人
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