以下是关于大鼠原代角膜成纤维细胞分离培养的详细方法及注意事项，结合相关实验技术要点：

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一、组织取材与预处理‌

‌取材要求‌

建议使用新生0-3天SD大鼠（角膜组织更易消化且细胞活性高）‌。

无菌条件下取出眼球，在体视显微镜下剥离角膜基质层，避免混入结膜或虹膜组织‌。

‌组织清洗‌

立即用预冷PBS（含400U/mL青霉素+链霉素）冲洗3次，去除血污及杂质‌。

精细修剪角膜组织，去除残留的角膜上皮和内皮层‌。

‌二、细胞分离方法‌

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酶消化法（推荐）‌

使用IV型胶原酶（0.1-0.3mg/mL）37℃震荡消化60分钟，避免过度消化导致细胞损伤‌。

消化后加入含DNA酶I（100-300U）的培养基终止消化，防止细胞粘连‌。

‌机械法辅助‌

若组织较硬，可先用眼科剪剪碎至1mm³小块，再结合酶消化‌。

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三、细胞培养与纯化‌

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接种与贴壁‌

培养皿需预包被鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm²）或多聚赖氨酸（0.1mg/mL）‌。

接种密度建议5×10⁴~1×10⁵ cells/cm²，避免密度过低影响存活率‌。

‌培养基配方‌

基础培养基：DMEM/F12 + 10%-20%胎牛血清（FBS）‌。

强化添加：1%胰岛素或EGF（促进细胞增殖）‌。

‌纯化方法‌

差速贴壁法：角膜成纤维细胞贴壁较快（约20-30分钟），可去除未贴壁的杂质细胞‌。

免疫磁珠分选（可选）：通过CD90等标志物进一步纯化‌。

‌四、细胞鉴定与质量控制‌

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形态学观察‌

贴壁细胞呈梭形或星形，3-4天后汇合度达70%‌。

‌分子标志物检测‌

免疫荧光染色：vimentin（阳性）、α-SMA（肌成纤维细胞活化标志）‌。

功能验证：检测胶原合成能力（如甲苯胺蓝染色）‌。

‌五、常见问题处理‌

‌贴壁不良‌：检查包被条件或血清批次，必要时补加5%大鼠血清临时促贴附‌。

‌污染‌：立即丢弃污染样本，彻底消毒培养箱及操作台‌。