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白色念珠菌染料法荧光定量PCR试剂盒
白色念珠菌染料法荧光定量PCR试剂盒图片
包装: 50次
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产品别名:Candida albicans SYBR qPCR Kit
产品介绍

产品及特点

本公司开发了白色念珠菌染料法荧光定量 PCR试剂盒,它具有下列特点:

1、即开即用,用户只需要提供 DNA模板。

2、引物根据白色念珠菌专一区设计,特异性高。

3、荧光定量 PCR检测,比常规 PCR更加灵敏。

4、一管式闭管操作,降低了交叉污染。

5、本试剂盒足够 50次 20μL反应体系的荧光定量 PCR。

6、本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。

规格及成分

成分编号塑料盒包装
2×qPCR MagicMix90408500 μL(棕色管)
荧光 PCR专用模板稀释液1807011 mL(黄盖)
白色念珠菌染料法 qPCR引物混合液14-60210yw100 μL(白盖)
白色念珠菌染料法 qPCR阳性对照(1×108拷贝/μL)60908-60210pc50  μL(黄盖)
使用手册14-60210sc1份

运输及保存

低温运输、-20℃保存,有效期一年。

自备试剂

DNA模板、超纯水、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)。

使用方法

一、稀释 PCR阳性对照(以 102-107拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)

1、注意:由于阳性对照浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。

2、标记 6个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

3、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液(**用带芯枪头,下同)。

4、在 7号管中加入 5 μL  1×108拷贝/μL的阳性对照,充分震荡 1分钟,得1×107拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5、换枪头,在 6号管中加入 5 μL  1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1分钟,得 1×106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6、换枪头,在 5号管中加入 5 μL 1×106拷贝/μL的阳性对照到 5号管中,充分震荡 1分钟,得 1×105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

8、如果有 N个样品,必须设置 N+2个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL PCR阳性对照的 10000倍稀释的(稀释后浓度为 1×104拷贝/μL,10μL相当于 10万拷贝,可以将 10μL原液加入到 990μL自备 TE溶液中,充分混匀,此为 100倍稀释液。再取 10μL此稀释液加入到 990μL自备 TE溶液中,充分混匀,此为 10000倍稀释液)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 DNA。

9、用自选方法纯化 N+2个样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

三、设置 qPCR反应(20  μL体系,在样品制备室进行)

10、如果做定量分析并且只做 1次重复,则标记 N+9个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照,6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1次重复,则标记 N+4个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照(用水做模板),1个用于 PCR阳性对照(用第 4号阳性对照稀释液,浓度为 104拷贝/μL)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把 6个标曲反应缩减成 1个,其余不变。

11、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):

成分样品管N+2个PCR阴性对照管PCR阳性对照管(2-7管)
2×qPCR MagicMix10  μL10  μL各 10  μL
白色念珠菌染料法 qPCR引物混合液2  μL2  μL各 2  μL
自备 10×ROX (见注)2  μL2  μL各 2  μL
N+2待测样品 cDNA模板6  μL--
自备超纯水-6-
第 7步所得 PCR阳性对照稀释液(2-7号)--各 6μL(2号样到2号管,3号样到 3号管…)

注:仅 ABI7500、7700和 7900仪器需要使用 ROX作为对照,其他荧光 PCR仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和 LightCycler480)不需要使用 ROX,则用水替代。

12、盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR(具体 PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。

过程温度时间
预变性95℃5 min
PCR反应(40个循环)95℃15 sec
PCR反应(40个循环)60℃1 min,(采集  SYBR通道的荧光信号)
按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

13、如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log值为横轴,以 Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 cDNA浓度的 log值,再推算出其浓度。

14、如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct必须大于或等于 35。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其 Ct大于或等于 35则为阴性,如果小于或等于 30则为阳性。如果在 30-35之间,可结合熔解曲线判断,若样品的熔解温度与阳性对照相同,该样本判断为阳性,否则为阴性。

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