鹌鹑奇异线虫探针法荧光定量PCR试剂盒实验规则：

1、要保证移液枪的准确性，误差不能超过2%。可用水和电子天平进行确定。但有专业人员进行矫正。

2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。吸取不同的液体后，要更换枪头。即使是吸取标准品时。

3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。

4、实验时，要使底物避光保存。

5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。

6、吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。

7、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触，可使枪头上的液滴和孔壁接触，液滴会自然流下去。

8、液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒，混匀液体。也可以用酶标仪的晃动功能。

9、应尽量做双孔实验，这样才能保证数据的准确性。

10、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。

11. 反应板封膜时需避免产生气泡，建议采用"Z"字形刮板法贴膜。若使用光学封板膜，需用无尘布擦净表面指纹和液体残留，以免影响荧光信号采集。

12. PCR管分装时应采用"预冷离心"策略：将八联管置于冰盒上预冷30秒后再分装反应液，可有效减少管壁挂液现象。每批实验需预留2个空白对照孔，加入等量无核酸酶水替代模板。

13. 荧光信号采集阶段，建议设置"阶梯式升温"程序：在延伸步骤结束后保持60℃ 15秒再采集信号，可使探针荧光信号更稳定。当Ct值＞35时，需复核扩增曲线是否呈现标准"S"型。

14. 耗材选择上，推荐使用低吸附透明PCR管。实验前需用纳米级纯水润洗枪头内壁三次，特别是检测低浓度样本时(＜10 copies/μL)，该步骤能减少核酸吸附损失。

15. 数据分析阶段应采用"双阈值法"：除仪器自动设定阈值外，手动设置二次阈值位于指数增长期3-15个循环之间。当两种阈值计算的Ct值差异＞1.5时，该数据应视为异常值。

16. 实验环境需维持正压状态，超净工作台应提前30分钟开启UV灭菌。操作人员佩戴的丁腈手套需每20分钟更换一次，避免RNase污染造成假阴性。

17. 对于临界值样本(Ct值在35-38之间)，建议采用"稀释验证法"：将原样本作1:5稀释后重复检测，若Ct值偏移量符合理论计算值(△Ct≈2.3)，则判定为真阳性。

18. 每批次实验应加入"过程控制标品"，该标品为人工合成的鹌鹑线虫保守序列，浓度梯度设置为10^2-10^6 copies/μL。各浓度点回收率应在85%-115%之间，否则整板数据作废。

19. 数据记录需同步保存原始荧光曲线图和仪器生成的ROX校正曲线。当内参基因(如18S rRNA)的Ct值波动＞1个循环时，提示可能存在RNA降解或抑制物干扰。

20. 实验结束后所有接触过核酸的耗材应浸泡在1%次氯酸钠溶液中过夜，经121℃高压灭菌处理后方可丢弃，防止气溶胶污染导致实验室交叉污染。