在实验操作过程中，需特别注意以下关键环节以确保检测结果的准确性和可靠性：

1. 样本处理标准化

样本采集后应立即置于冰上运输，避免反复冻融导致的病毒RNA降解。组织样本需经研磨后加入裂解液充分匀浆，离心取上清时应严格控制转速和时间，防止细胞碎片干扰。对于黏液较多的口腔拭子样本，建议先用蛋白酶K预处理30分钟以提高核酸释放效率。

2. 反应体系配制精准度

移液器需定期校准，建议使用低吸附枪头分装试剂。配制预混液时应按N+2原则准备过量试剂，避免分装误差。特别注意引物探针混合液的避光保存，冻存复苏后需涡旋振荡10秒确保充分混匀。反应板封膜前需检查各孔液面是否平整，避免产生气泡影响热传导。

3. 扩增程序优化

建议在PCR仪预热完成后再放入反应板，温度梯度实验显示95℃预变性时间缩短至30秒可有效减少引物二聚体形成。对于高GC含量的靶序列，可将延伸温度调整为68℃并延长5秒。每批实验应设置3个复孔，Ct值变异系数超过5%需重新检测。

4. 污染防控措施

实验分区应严格遵循单向流程，核酸提取区与扩增区需保持气压差。每日实验前后用0.5%次氯酸溶液擦拭台面，紫外照射时间不少于30分钟。所有废弃耗材需经121℃高压灭菌处理，特别注意离心管开盖时的气溶胶污染风险。

5. 质量控制要点

每批次实验必须包含阴性对照(无模板对照)和阳性对照(质粒标准品)，其中阳性对照Ct值应在22-25区间浮动。建议每20个样本插入1份已知弱阳性样本作为过程对照，其检出率低于80%时需排查试剂活性问题。数据分析时应注意扩增曲线拐点形态，排除非特异性扩增干扰。