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2020版《中国药典》 | 睿科中药材中黄曲霉毒素测定的解决方案
2020.03.12   点击848次

1、介绍

黄曲霉毒素(Aflatoxins, AF)是一类由黄曲霉和寄生曲霉产生的代谢产物,具有诱发人体致畸、致癌、致突变的作用,主要的污染物有黄曲霉毒素B1, B2, G1, G2。中药材大多以天然植物为基源,在储存不当或因其他外界条件影响时,易受霉菌污染产生黄曲霉毒素。因此对中药材进行黄曲霉毒素的高效便捷检测是十分有必要的。

参考2020年版《中国药典》四部通则中《2351 真菌毒素测定法 黄曲霉毒素测定法》第一法,试样经过70%甲醇水提取,提取液经稀释、离心后,使用Raykol Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪,滤液自动化经过含有黄曲霉素特异抗体的免疫亲和柱净化和富集后,目标化合物通过带有三重四级杆质谱检测器的高效液相色谱仪进行测定,建立了中药材中黄曲霉毒素高灵敏度的前处理和分析方法,并进行三种常见中药材(陈皮、人参、当归)中黄曲霉毒素的加标回收验证,平均回收率在84.5~101.3%之间,RSD小于10%。

2、仪器、耗材

仪器

Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪

Raykol Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪

Raykol AH-30 全自动均质器

Raykol Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站

高效液相色谱(HPLC):Agilent 1200

质谱检测器 (MS):Agilent 6430

耗材

黄曲霉毒素免疫亲和柱

试剂

缓冲液:称取25 g氯化钠、5 g碳酸氢钠溶于水中,加入0.1 mL吐温-20,用水稀释至1000 mL即得淋洗缓冲液。

使用Auto Prep 200全自动液体样品处理工作站配制黄曲霉毒素混合标准工作液,具体配制方法如图-1所示:

图-1 Auto Prep 200 黄曲霉毒素混合溶液配制方法

空白基质溶液用Auto EVA -60全自动平行浓缩仪氮吹后,分别加入1 mL上述混合标准工作溶液复溶,过0.22 μm的有机相滤膜后配制成基质混合工作溶液,供液相色谱-质谱联用仪测定。

3、样品提取与前处理

陈皮、人参、当归试样前处理

准确称取15 g试样于120 mL离心管中,加入3 g氯化钠及75 mL甲醇-水溶液(7:3,V/V),12000转/分钟搅拌速度下均质2 min,离心5 min(转速4000 r/min)。准确量取15 mL上层提取液于50 mL容量瓶中,用水定容、取30 mL至50 mL离心管中, 离心10 min(转速4000 r/min),最后准确移取20 mL上清液至80 mL玻璃上样管,待净化用。

固相萃取净化条件

净化方法

净化过程采用黄曲霉毒素免疫亲和柱进行富集净化,具体方法如下:

清洗样品通道:用甲醇清洗;

上样:采用2 mL/min的流速进行精确上样20 mL;

淋洗:采用缓冲液和纯水进行淋洗小柱;

气推:用60 mL空气将水挤出免疫亲和柱;

洗脱:以0.5 mL/min的速度用甲醇进行洗脱,开始收集溶液;

气推:将柱子里溶液用空气推出,收集溶液。

将收集液用甲醇定容至2 mL,混匀后过0.22 μm滤膜用液质检测。详细步骤见图-2。

图-2 Fotector Plus黄曲霉毒素的免疫亲和净化方法

4、液质联用色谱图

4种黄曲霉毒素标准溶液的MRM色谱图

5、样品测试

基质标准工作曲线

选择定量离子的峰面积作为纵坐标,浓度作为横坐标,做相关曲线,曲线为线性回归,各点权重相等,拟合出工作曲线,要求R2>0.99。

基质加标回收实验

在陈皮、人参、当归3种常见样品基质中添加水平为1.8 μg/kg的黄曲霉毒素G2、B2和6.0 μg/kg的黄曲霉毒素G1、B1进行加标回收验证,平均回收率和RSD结果见下表:

表-1 平均回收率和相对标准偏差 (n=4)

6、总结

A.提取液需加入水进行稀释、定容至50 mL后才可进行净化,以防止过多的有机溶剂使免疫亲和柱失活。

B.在人参和当归的净化过程中,如采用20 mL水作为淋洗液,其加标回收率为70~80%;而将10 mL的缓冲液和10 mL的纯水作为淋洗液时,可除去免疫亲和柱上残留的色素和基质,从而提高回收率。

C.进行洗脱时甲醇的过柱流速控制在1滴/s为宜。洗脱效果不佳时,可采取让甲醇浸泡免疫亲和柱后再加以洗脱。

D.由于黄曲霉毒素在紫外光照射下不稳定,因此在实验过程中应避免紫外光和太阳光的照射。

7、解决方案优势

通过高通量全自动固相萃取仪进行净化和富集,能自动化进行免疫亲和柱自动脱帽和样品上样、淋洗和洗脱等过程,8种溶剂可选,6个样品通道同时运行,能连续、批量处理多样品,实现高通量、自动化固相萃取过程。

整体解决方案可实现样品快速高效处理,提高工作效率。同时自动化前处理解决方案可解放实验人员双手,也避免有机溶剂的毒害。

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